clemente associates TRIC Cell流程

1、制備帶有結(jié)合抗HLA-G的納米顆粒。在操作前一天，用小鼠單克隆抗HLA-G抗體（BD）將磁性納米顆粒與山羊抗小鼠IgG（clemente associates）偶聯(lián)。結(jié)合100μL無菌PBS、10μL抗體（0.5 mg/mL）和10μL納米粒。在4°C的冷藏室搖桿上攪拌過夜。第二天，通過首先添加900μL無菌PBS，然后磁化粒子10分鐘，去除所有液體，去除未結(jié)合抗體。

2、初始宮頸內(nèi)樣本到達(dá)ThinPrep溶液。400 x g的顆粒細(xì)胞持續(xù)5分鐘。將細(xì)胞顆粒重新放入12-13 mL無菌PBS中，最終體積為14 mL。

將樣品穿過插入15 mL離心管的250μm組織過濾器，以去除大塊粘液和細(xì)胞團(tuán)。

3、通過離心和在14 mL無菌PBS中重新懸浮細(xì)胞，將宮頸樣品清洗2次。

最后一次清洗細(xì)胞后，將樣品重新懸浮在1.4 mL無菌PBS中。向樣品中添加100μL抗HLA-G涂層磁性納米顆粒（制備于#1）以分離滋養(yǎng)層細(xì)胞。在4°C的冷藏室搖桿上培養(yǎng)過夜。

隔夜孵育后，將滋養(yǎng)層細(xì)胞在4℃的磁鐵（DynaMagSpin磁鐵；Life Technologies）上分離5分鐘。使用磁鐵，在4℃下用1 mL無菌PBS清洗滋養(yǎng)層細(xì)胞3次（在移液前讓納米粒子磁化10分鐘）。最終移除未結(jié)合的細(xì)胞后，將捕獲的細(xì)胞在4℃下重新懸浮在100μL無菌PBS中。

6、取一小份分離的細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)分離的胎兒細(xì)胞，計(jì)算回收的胎兒細(xì)胞總數(shù)。使用血細(xì)胞儀對(duì)第一次清洗的母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

為了檢查細(xì)胞的純度，用抗-?hCG。

確定熒光燈數(shù)量?hCG陽性細(xì)胞和總細(xì)胞（DAPI標(biāo)記）。

派生%?hCG陽性。